熒光是一種直接成像方法，使用熒光染料 - 也稱為熒光團或探針 - 附著在二抗上。雖然大約80％的研究人員繼續使用基于酶的化學發光進行Western印跡，但由于成像和熒光團技術的改進以及更多可用的抗體，熒光成像作為一種優選的方法正在迅速發展。熒光提供了優于傳統化學發光的幾個優點，包括：1）多重靶蛋白的能力，而不一定需要剝離和重新探測，2）增強的定量檢測，以及3）由于穩定性而存檔和重新成像印跡的能力。熒光分子。大多數西方方案可以很容易地從化學發光或比色方法改編，但需要進行一些優化。以下是一些技術，以避免使用熒光檢測時常見的陷阱。
盡管使用當今的技術可以檢測三種蛋白質（或更多），但大多數研究人員將多重化限制在兩種蛋白質上。印跡上結合的蛋白質越多，優化就越復雜。因此，建議在同時檢測多個目標之前檢測每種目標蛋白質。單目標檢測有助于在多重分析之前確定每種抗體的條帶模式。建議用藍色通道檢測**強的目標蛋白，用綠色通道檢測中間目標，用紅色通道檢測較弱的蛋白質。（膜具有更高的固有熒光和短波長激發（藍色）。）此外，始終使用來自不同物種的一抗 - 例如小鼠到山羊 - 作為從兩個密切相關的物種產生的抗體 - 例如
多重研究中的一個常見問題 - 特別是在蛋白質重量相似并且緊密遷移的翻譯后修飾研究中 - 是跨通道熒光或滲透。滲透是指您在拍攝藍色圖像時拍攝樂隊，例如拾取Cy3（綠色）頻道。為了避免串擾，研究人員應該驗證二級抗體與熒光團結合，具有非重疊的發射光譜。在獲取圖像之前，還需要仔細檢查發射濾波器，因為濾波器旨在覆蓋特定的帶通。
使化學發光方案適應熒光的一個挑戰是修改抗體濃度。通常，對于正確的信號，一級抗體濃度應比標準化學發光方案增加二**五倍。然而，極高的抗體濃度也會增加背景噪音。（理想情況下，您需要低背景噪音，這會產生更高的信號背景比。）高抗體濃度也會導致非特異性結合。因此，優化抗體濃度對于獲得**佳結果**關重要。試驗濃度的簡單方法是以各種稀釋度為每種抗體孵育膜。二抗也可能需要優化 - 1：5,000稀釋是一個很好的起點。
通過化學發光，發射的光的比例與局部酶 - 底物濃度相關。暴露不需要直接光源 - 更多的酶在限時反應中產生更多光。結果，目標信號永遠不必與跨膜的自發熒光競爭。（據報道，當使用低蛋白質水平時，化學發光比熒光更敏感的原因之一。）使用熒光檢測時，解決這個問題的一個簡單方法是用低熒光PVDF膜代替標準PVDF膜。這些膜可增加轉移蛋白質的每個通道的信號與背景比，從而產生明亮的清潔條帶。為了進一步減少熒光偽影，避免使用墨水標記膜，戴上粉末丁腈手套時不要處理，處理膜時要確保溫和。雖然在工作日光條件下光漂白熒光標記的抗體沒有風險，但所有熒光標記的抗體庫存應該存放在黑暗中。
總之，值得注意的是，所有熒光成像系統都是數字化的。使用熒光成像的樂趣之一是研究人員可以輕松捕獲的驚人的出版物圖像。雖然數字成像儀的入門價格對于許多實驗室而言可能過高 - 數字成像儀的起價大約為30,000美元，高達10萬美元 - 此后每次反應的價格與化學發光相比顯著下降。隨著越來越多的研究人員多路復用并要求更好的線性，用于蛋白質印跡的熒光成像很可能在未來幾年成為行業標準。